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NEWSXPJ血清脂蛋白电泳操作流程
来源:林文琦 日期:2025-03-19XPJ的实验原理是通过脂类染料(如苏丹黑或油红O等)对血清脂蛋白进行预染,然后将预染的血清置于琼脂糖凝胶板进行电泳分离。在电流作用下,脂蛋白向正极移动并被分离成多个区带。
1. 巴比缓冲液(pH 8.6,离子强度 0.075):作为电极缓冲液,配制时需要154克巴比/妥钠,276克巴比/妥,0.292克EDTA,溶解后加水至1000毫升。
2. 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 8.6):用作凝胶缓冲液,配置时需121.2克三羟甲基氨基甲烷,0.29克EDTA,15.85克NaCl,溶解后也加水至1000毫升。
3. 琼脂糖凝胶:将0.45克琼脂糖与50毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲液和50毫升水混合后加热至沸腾,待琼脂糖完全溶解后立即停止加热。
4. 制作切口刀:刀口长度为15毫米,中间夹一有机玻璃或木片,并用螺丝固定以保持刀片间距15毫米。挖槽小匙使用直径15毫米、长度约6厘米的铜丝制成,一端锤成扁平并用砂纸磨光。
5. 电泳槽和电泳仪:与血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳所需的设备相同。
1. 预染血清:将0.2毫升血清与0.2毫升苏丹黑染色液混合在小试管中,放在37℃水浴中染色30分钟,然后以2000转/分离心约5分钟。
2. 制备琼脂糖凝胶板:将已配制的0.45%琼脂糖凝胶在沸水浴中加热融化,用吸管吸取凝胶液滴入载玻片,每片约25毫升。静置约半小时后凝固(高温环境下可能需要延长时间,有必要可放入冰箱加速凝固)。
3. 点加血清:在凝固的琼脂糖凝胶板一端约2厘米处用切口刀垂直切入,取出刀片后,用铜丝小匙挖去长条凝胶。用小片滤纸吸干小槽内部的水分,然后用血色素吸管吸取已预染的血清约15微升,注入凝胶板的小槽内。
4. 电泳:将含血清的凝胶板平行放置于电泳槽中,样品端应靠近阴极。将两块纱布浸润于巴比/妥缓冲液中,轻轻贴在凝胶板两端,纱布的另一端浸在电泳槽中的缓冲液中(切忌用三羟甲基氨基甲烷缓冲液替代)。接通电源,电压设定为120~130V,每片电流为3~4mA。经过约15至55分钟后,可观察到分离的色带。
1. 电泳样品需使用新鲜的空腹血清。
2. 每块凝胶上可平行挖两个小槽,便于添加两个样品。
3. 若使用与小槽形状大小相同的有机玻璃片,在琼脂糖凝胶固化前固定在适当位置,凝固后取出有机玻璃片,凝胶板上将保留小槽,无需挖槽。
4. 若需保留电泳样本,可将电泳后的凝胶板(连同载玻片)放入清水中浸泡脱盐2小时,再置于烘箱(约80℃)烘干。
1. 正常人血清脂蛋白可显示三条区带:从负极到正极依次为β-脂蛋白(最深)、前β-脂蛋白(最浅)、α-脂蛋白(稍深于前β-脂蛋白),原点处应无乳糜微粒。
2. 若前β-脂蛋白比α-脂蛋白深,结合血清甘油三酯明显升高且胆固醇正常或略高,可判定为Ⅳ型高脂蛋白血症。
3. 若β-脂蛋白区带明显加深且血清总胆固醇增高、甘油三酯正常,属Ⅱa型;若血清总胆固醇增高而前β-脂蛋白略溶解,则为Ⅱb型。
4. 当β-和前β-两区带连在一起,称为“宽β区带”,且结合血清甘油三酯和胆固醇均增高,可定为Ⅲ型。
5. 若原点出现乳糜微粒,而β-和前β-均正常或减低,结合血清甘油三酯显著升高,可判定为Ⅰ型。
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